Cas12a2 вызывает абортивную инфекцию через РНК

Nov 06, 2023

Nature, том 613, страницы 588–594 (2023 г.) Процитировать эту статью

18 тысяч доступов

5 цитат

429 Альтметрика

Подробности о метриках

Бактериальные системы прерывания инфекции ограничивают распространение чужеродных захватчиков, отключая или убивая инфицированные клетки до того, как захватчики смогут размножиться1,2. Некоторые системы CRISPR-Cas, нацеленные на РНК (то есть типы III и VI), вызывают фенотипы абортивной инфекции путем активации неизбирательных нуклеаз3,4,5. Однако механизм прерывания беременности, опосредованный CRISPR, который использует неизбирательную ДНКазную активность РНК-направляемой одноэффекторной нуклеазы, еще не наблюдался. Здесь мы сообщаем, что нацеливание на РНК с помощью одноэффекторной нуклеазы Cas12a2 типа V приводит к прерыванию инфекции посредством неспецифического расщепления двухцепочечной ДНК (дцДНК). После распознавания РНК-мишени с активирующей последовательностью, фланкирующей протоспейсер, Cas12a2 эффективно разрушает одноцепочечную РНК (оцРНК), одноцепочечную ДНК (оцДНК) и дцДНК. Внутри клеток активация Cas12a2 вызывает реакцию SOS-повреждения ДНК и нарушает рост, предотвращая распространение захватчика. Наконец, мы использовали побочную активность Cas12a2 для прямого обнаружения РНК, продемонстрировав, что Cas12a2 можно использовать в качестве инструмента нацеливания на РНК, управляемого РНК. Эти результаты расширяют известные защитные возможности систем CRISPR–Cas и создают дополнительные возможности для технологий CRISPR.

Во всех сферах жизни используются защитные стратегии, которые заставляют клетки впадать в состояние покоя или умирать, чтобы ограничить распространение инфекционных агентов1. У бактерий и архей эта стратегия называется абортивной инфекцией и используется множеством бактериальных защитных систем1,2. Недавно было показано, что адаптивные иммунные системы, управляемые CRISPR РНК (crRNA), нацеленные на РНК, вызывают фенотипы абортивной инфекции3,4,5,6. Системы типа VI неспецифически разрушают РНК, при этом одноэффекторная нуклеаза Cas13 действует как эффектор, управляемый crRNA, и неизбирательная РНКаза3,7,8. В системах типа III связывание целевой РНК запускает выработку циклических олигоаденилатных вторичных мессенджеров, которые, в свою очередь, активируют неизбирательные дополнительные РНКазы и оцДНазы, которые могут вызывать абортивную инфекцию4,5,9,10,11. Более того, было высказано предположение, что абортивная инфекция опосредуется неизбирательными dsDNases (такими как NucC), активируемыми посредством вторичных мессенджеров типа III12,13, или неизбирательной активностью ssDNase из одноэффекторных нуклеаз Cas12a типа V14. Однако активность дцДНКазы III типа, опосредованной CRISPR, еще предстоит изучить in vivo, а недавно было показано, что оцДНКазная активность Cas12a не вызывает абортивной инфекции15.

Здесь мы сообщаем, что Cas12a2, одноэффекторная CRISPR-ассоциированная (Cas) нуклеаза типа V, индуцирует фенотип абортивной инфекции при заражении плазмидами, которые комплементарны направляющим crRNA. Биохимические анализы с использованием рекомбинантного белка показали, что Cas12a2 распознает мишени РНК, высвобождая неспецифическую активность дцДНК, оцДНК и оцРНК, отличающуюся от активности других односубъединичных РНК (таких как Cas13a) и дцДНК (таких как Cas12a). ) Cas-нуклеазы8,16,17. Кроме того, мы показываем, что неспецифическая активность нуклеазы Cas12a2 повреждает бактериальную ДНК, вызывая SOS-ответ и нарушая рост клеток. В совокупности эти результаты позволяют предположить, что дцДНКазная активность Cas12a2 играет важную роль в запуске фенотипа абортивной инфекции. В качестве доказательства принципа мы показываем, что Cas12a2 может обнаруживать РНК с чувствительностью, сравнимой с чувствительностью нуклеазы Cas13a, нацеленной на РНК, при различных температурах.

Cas12a2 включает группу эффекторных нуклеаз типа V, родственных Cas12a16, причем ортологи Cas12a2 ранее классифицировались как варианты Cas12a18. Наш анализ аналогичным образом помещает их в монофилетическую кладу, которая имеет последнего общего предка с нуклеазами Cas12a (рис. 1a и расширенные данные, рис. 1). Дальнейший анализ показал, что системы CRISPR-Cas12a2 и CRISPR-Cas12a содержат повторы CRISPR с консервативным 3'-концом, а нуклеазы обладают гомологичными эндонуклеазными доменами RuvC и схожей предсказанной вторичной структурой на N-концах (рис. 1b и дополнительная рис. 2). . Несмотря на консервативные RuvC-подобные домены и N-концы, Cas12a2 отличается от Cas12a наличием большого домена с неизвестной функцией, расположенного вместо мостиковой спирали Cas12a, а также домена «цинковых пальцев» вместо домена Cas12a Nuc ( Рис. 1b и дополнительный рисунок 2). Учитывая их первоначальную классификацию в сочетании с нашим филогенетическим анализом, а также недавними структурными результатами19, мы назвали эти отдельные нуклеазы типа V Cas12a2.